¿Qué es la electroforesis bidimensional?

noviembre 8, 2021by Kalstein

La electroforesis bidimensional es un tipo especial de electroforesis, considerada una técnica de alta resolución que permite la separación de mezclas de proteínas complejas, gracias a su bidimensionalidad, característica distintiva que le ofrece su poder de resolución.

En esta técnica las proteínas son separadas secuencialmente mediante dos criterios físicos. Primeramente, las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en un entorno desnaturalizante de acuerdo a su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Luego de esta separación por cargas las proteínas son separadas de acuerdo a su masa molecular o tamaño por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).

La electroforesis bidimensional (IEF+SDS-PAGE) es la técnica más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma (conjunto de proteínas que se expresan a partir de un genoma en un momento dado).

Isoelectroenfoque (IEF)

El Isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que se emplea para separar moléculas cargadas. Se basa en que una proteína tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que posee un punto isoeléctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cuál la molécula posee carga neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico. Al aplicar la diferencia de potencial las proteínas que se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente, y migraran hacia el cátodo; mientras que aquellas que se encuentran en regiones de pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo.

Electroforesis SDS-PAGE

En este tipo de electroforesis se utiliza el dodecil sulfato de sodio (SDS), que es un detergente ampliamente usado en preparaciones bioquímicas debido a que se une con firmeza a las proteínas y las hace asumir una estructura desordenada de manera de obtener una eficiente desnaturalización.

Esta técnica permite la separación de las proteinas en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración por geles.

Etapas de la electroforesis bidimensional

  • Preparación de la muestra: Aquí se utilizan agentes caotrópicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentes caotrópicos, como la urea, provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores, como el DTT (Dithiothreitol, aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro.
  • Separación en la 1ª dimensión (Isoelectroenfoque): Ocurre la separación de la mezcla de proteínas según sus puntos isoeléctricos.
  • Separación en la 2ª dimensión (SDS-PAGE); Las proteínas se separan en función de su peso molecular.
  • Revelado; Los métodos más usados son la tinción con azul Coomassie que se fija a las proteínas, pero no al gel, la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la tinción con Plata. La tinción de azul Coomassie clásica puede detectar normalmente bandas de proteína de 50 ng, mientras que la tinción con plata incrementa este límite de sensibilidad en unas 50 veces.

Aplicaciones de la electroforesis bidimensional

La principal aplicación de la electroforesis bidimensional es la proteómica de expresión; con esta técnica se puede comparar de forma cualitativa y cuantitativa la expresión de proteínas de dos muestras. Ha sido ampliamente utilizada en la elaboración de mapas de referencia, es decir en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo celular. Estos mapas se utilizan para comparar diversos experimentos, como tratamientos con fármacos o compuestos tóxicos, tejidos sanos o enfermos, condiciones de cultivos, leneas celulares normales y tumorales, es allí donde la electroforesis bidimensional adquiere su máxima funcionalidad.

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